Zespół II

Profil badawczy

Terapeutyczne zastosowania substancji psychodelicznych

Obecne zainteresowania Zespołu II koncentrują się na badaniu przeciwdepresyjnego mechanizmu substancji psychodelicznych takich jak występująca naturalnie w grzybach psylocybinowych - psylocybina. W ramach projektu finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki (OPUS 19) pragniemy ocenić czy psylocybina odwraca zachowania depresyjne u szczurów, które są odpowiednikiem depresji u ludzi w modelu chronicznego łagodnego stresu. To działanie psylocybiny wymaga zbadania procesów neurobiologicznych takich jak wpływ na neuroprzekaźnictwo mózgowe, plastyczność synaptyczną, hormonów odpowiedzialnych za stres, integralność materiału genetycznego. Wstępne badania sugerują, że psylocybina w znaczny sposób wpływa na poziom neuroprzekaźników mózgowych takich jak dopamina, noradrenalina, serotonina, acetylocholina, glutaminian i GABA w wybranych strukturach mózgu. Zmianom tym towarzyszą zaburzenia niektórych elementów zachowania związanych z lękiem i ogólną aktywnością motoryczną. 

Neurotoksyczność nowych substancji psychoaktywnych z grupy halucynogenów

Nowe substancje psychoaktywne (NSP) czyli popularne dopalacze obejmują szeroko zróżnicowaną grupę substancji, m. in. takich jak psychostymulanty i halucynogeny serotoninergiczne. Wśród halucynogenów serotoninergicznych dużą popularność zyskały NBOMy jako „komercyjne LSD”. Substancje te wykazują wysokie powinowactwo do receptorów serotoninowych 5-HT2A, które koreluje z siłą ich działania. NBOMy wykazują silne efekty w bardzo niskich dawkach, na poziomie mikrogramów, co stwarza niebezpieczeństwo ich przedawkowania. W literaturze klinicznej znajduje się wiele doniesień o ostrych zatruciach oraz zgonach, powiązanych ze środkami, w składzie których zidentyfikowano NBOMy. W projekcie NCN OPUS 11 zbadano wpływ dwóch związków 25I-NBOMe i 25B-NBOMe na ośrodkowy układ nerwowy oraz zachowanie zwierząt. W badaniach in vivo wykazano, że obie substancje w szerokim zakresie dawek  wywołują aktywność halucynogenną u szczurów ocenianą na podstawie liczby epizodów otrzepywania się (WDS), efektu przypominającego otrzepywanie się mokrego psa po wyjściu z wody. Zachowanie to skorelowane było ze zwiększonym uwalnianiem glutaminianu w korze czołowej, gdzie znajduje się największa gęstość receptorów 5-HT2A występujących na komórkach piramidowych, głównie w warstwie V kory. Jako pośredni efekt pobudzenia komórek piramidowych obserwowano również zwiększone uwalnianie dopaminy (DA), serotoniny (5-HT) i acetylocholiny (ACh) w korze czołowej, jądrze półleżącym przegrody i w prążkowiu. Ciekawą obserwacją w naszych badaniach było wystąpienie tolerancji na efekt obu związków po podaniu dawek wielokrotnych, zarówno we wpływie na uwalnianie neuroprzekaźników, jak też w aktywności halucynogennej. Tak więc, przeprowadzone badania sugerują, że 25I-NBOMe i 25B-NBOMe stymulując receptor 5-HT2A zlokalizowany głównie w korze czołowej, wywołują aktywność halucynogenną, której towarzyszy zwiększone uwalniane glutaminianu. Pobudzenie komórek piramidowych wpływa na zmiany funkcji jąder podkorowych oraz może odpowiadać za efekt prolękowy NBOMów. Zwiększone uwalnianie DA w jądrze półleżącym przegrody sugeruje możliwe działanie nagradzające z konsekwencją rozwoju uzależnienia. 

Neurotoksyczność nowych substancji psychoaktywnych z grupy psychostymulantów

Substancje psychoaktywne reprezentowane przez pochodne amfetaminy, 4-metoksyamfetaminę (PMA) i 4-metoksy-N-metyloamfetaminę (PMMA), pochodną katynonu, mefedron oraz związek halucynogenny 5-metoksy-N,N-diizopropylotryptaminę (5-MeO-DIPT), podane w dawkach jednorazowych istotnie zwiększały uwalnianie dopaminy, serotoniny i glutaminianu w strukturach korowych i jądrach podkorowych mózgu dorosłego szczura. Substancje te podane w dawkach wielokrotnych zwierzętom w okresie dojrzewania powodowały zmianę w odpowiedzi behawioralnej na dawkę przypominjącą po uzyskaniu dojrzałości, co sugeruje trwałe zaburzenie funkcji szlaków nerwowych. Ekspozycja młodych zwierząt na badane stymulanty i związek halucynogenny powodowała wystąpienie zmian adaptacyjnych w układzie dopaminowym, ale deficyty w układzie serotoninergicznym utrzymywały się do okresu dorosłości, co świadczy o trwałym uszkodzeniu zakończeń serotoninowych przez PMA, PMMA i mefedron. Ponadto, wszystkie substancje wywoływały oksydacyjne uszkodzenie jądrowego DNA w obszarach korowych oraz zwiększenie aktywności kaspazy-3 u zwierząt po osiągnięciu dorosłości, co jest dowodem na wystąpienie stresu oksydacyjnego pod ich wpływem. 

Odrębnym projektem Zespołu II było badanie neurotoksycznego działania MDMA (popularnej ekstazy) podawanej łącznie z kofeiną, którą znajdowano w tabletkach typu "party pills" stosowanych w celach rekreacyjnych. Obie substancje powodowały drastyczne zmiany w uwalnianiu monoamin w mózgu myszy po podaniach jednorazowych i wielokrotnych. Obserwowane było także znaczne uszkodzenie DNA świadczące o obecności stresu oksydacyjnego. Wykazano ponadto, że MDMA spowodowała uszkodzenie białek transporterowych DAT i SERT jako markerów zakończeń neuronów dopaminowych i serotoninowych. Kofeina nasilała wywołane przez MDMA uszkodzenia korowych zakończeń serotoninowych, ale zmniejszała uszkodzenie zakończeń dopaminowych. 

Popularną grupę substancji psychoaktywnych stanowią syntetyczne pochodne katynonu (tzw. Β-keto-amfetaminy o działaniu stymulującym. W ramach projektu NCN OPUS 7 badano właściwości neurochemiczne i aktywność biologiczną pochodnych N-alkilowych (metylokatynon i 3-fluorometylokatynon), oraz pochodne N-pirolidynowe pierwszej (pirowaleron, 2,3-MDPV, 3,4-MDPV) i drugiej generacji (α-PVP, PV8, PV9). Wykazano neurotoksyczne działanie pochodnych katynonu poprzez uszkodzenie DNA neuronów. Maksymalny efekt genotoksyczny pochodnych pirowaleronu wzrastał wraz z wydłużaniem łańcucha bocznego, ale zmniejszał się wtedy ich efekt psychostymulujący. Biorąc pod uwagę ten fakt, można sądzić, że pochodne te będą stosowane w wyższych dawkach, co ma istotne implikacje zdrowotne. W badaniach in vivo pochodne katynonu zwiększały pozakomórkowe stężenie dopaminy i serotoniny w prążkowiu, a więc strukturze zaangażowanej w procesy uzależnienia i aktywności ruchowej. 

Rola układu modulatorowego adenozyny w działaniu neuroprotekcyjnym

W związku z sugestiami o możliwym neuroprotekcyjnym działaniu agonistów receptorów adenozynowych w ramach projektu MNiSW (4 PO5A 048 10) badano neurochemiczny mechanizm związków CPA (agonista receptora adenozynowego A1), CGS 21680 (agonista receptora A2A) oraz APNEA (agonista receptora A3). Stwierdzono hamujący efekt tych agonistów na uwalnianie dopaminy w prążkowiu w modelu uszkodzenia zakończeń neuronów dopaminowych przez metamfetaminę. Ewentualne zastosowanie selektywnych agonistów receptorów adenozynowych jako związków neuroprotekcyjnych jest ograniczone wywoływaniem znacznych efektów niepożądanych po ich obwodowym podaniu. Alternatywą są substancje zwiększające poziom endogennej adenozyny pośrednio. Inhibitory deaminazy adenozyny (DCF), kinazy adenozyny 5’-jodotubercydyna (IOT) oraz inhibitor transportu zwrotnego, dilazep okazały się efektywniejsze od bezpośrednich agonistów receptorów adenozynowych w zmniejszaniu deficytu dopaminy wywołanemu metamfetaminą nie powodując sedacji. 

W związku z obserwacjami behawioralnymi, które sugerowały przeciwparkinsonowskie działanie antagonistów receptorów adenozynowych A2A w ramach projektów MNiSW (4 PO5F 025 18, 2 PO5F 044 27, N N405 272337) badano neuroprotekcyjny mechanizm związków, pochodnej metyloksantyny 8-(3-chlorostyrylo)kofeiny (CSC) i ZM 241385 na biotransformację L-DOPA, podstawowego leku w chorobie Parkinsona (PD). Stwierdzono, że selektywni antagoniści receptora adenozynowego A2A zastosowani w skojarzeniu z L-DOPA we wczesnym etapie PD mogą umożliwić obniżenie dawek tego prekursora dopaminy, a tym samym zredukować pojawienie się objawów niepożądanych jako rezultatu długotrwałego stosowania L-DOPA. Wykazano ponadto, że selektywni antagoniści receptora adenozynowego A2A zmniejszały produkcję wolnych rodników, których źródłem jest L-DOPA i powstająca dopamina. Tak więc antagoniści receptora adenozynowego A2A zastosowane jako suplement w terapii PD mogą mieć korzystne efekty przez hamowanie stresu oksydacyjnego. Podobnie, antyoksydacyjny efekt tych związków stwierdzono po uszkodzeniu neuronów czarnoprążkowiowych za pomocą 6-hydroksydopaminy. W badaniach tych, CSC i ZM 241385 poza zmniejszaniem produkcji rodnika hydroksylowego obniżały zwiększony poziom glutaminianu odpowiadającego za stres oksydacyjny w procesach ekscytotoksyczności. Kolejno, wykazano, że pochodne metyloksantyny, kofeina i KW-6002 zmniejszały produkcję rodnika hydroksylowego oraz wydzielanie glutaminianu w modelu zapalnym wywołanym LPS. Zaburzenie równowagi dopamina-glutaminian we wczesnej fazie PD wydaje się być istotną przyczyną nasilonych procesów wolnorodnikowych. Interesującą obserwacją było hamowanie produkcji wolnych rodników przez L-DOPA w warunkach całkowitego deficytu dopaminy czyli późnej fazy PD. Badania te wniosły ważny potencjał badawczy i przyczyniły się do zaproponowania nowej niedopaminowej terapii PD.

Badania we współpracy z innymi zespołami badawczymi

Zespół II zaangażowany był także badania spoza głównego nurtu zainteresowań. Obejmowały one wyjaśnieniu neurochemicznego mechanizmu interakcji leków przeciwdepresyjnych i przeciwpsychotycznych jako nowych alternatywnych terapii w depresji lekoopornej i chronicznej schizofrenii. Zespół II uczestniczył także w   projektach nad poszukiwaniem nowych leków antydepresyjnych i przeciwpsychotycznych wśród licznej grupy nowo zsyntetyzowanych ligandów i modulatorów podtypów receptorów metabotropowych dla glutaminianu. Badano także rolę metabotropowych receptorów dla glutaminianu w uwalnianiu dopaminy i ich rolę w działaniu neuroprotekcyjnym w zwierzęcych modelach neurotoksyczności. W poszukiwaniu leków przeciwdepresyjnych o większym marginesie bezpieczeństwa niż trójcykliczne leki przeciwdepresyjne i lepszym profilu farmakologicznym niż selektywne inhibitory pobierania doneuronalnego serotoniny lub noradrenaliny scharakteryzowano związki blokujące równocześnie doneuronalne pobieranie noradrenaliny, serotoniny i dopaminy, tzw. Triple reuptake inhibitors, TRI. Wyjaśniono ich profil neurobiologiczny wnioskując, że równoczesne zwiększanie wszystkich monoamin może być użyteczne w farmakoterapii depresji, w zaburzeniach związanych z lękiem, w zaburzeniach obsesyjno-kompulsywnych i zaburzeniach uwagi u dzieci. Ponadto, związki te mogą być zastosowane jako środki przeciwbólowe, szczególnie w znoszeniu bólu neuropatycznego. 

Techniki i metody stosowane w badaniach

Zespół II posiada długie doświadczenie w technikach wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją elektrochemiczną służącą do analizy związków występujących endogennie w mózgu o charakterze neuroprzekaźników i modulatorów takich jak dopamina, serotonina, noradrenalina, acetylocholina, glutaminian i kwas γ-aminomasłowy (GABA). Badania neuroprzekaźnictwa w strukturach mózgu szczura prowadzone są na poziomie uwalniania do przestrzeni pozakomórkowej w różnych strukturach mózgu metodą mikrodializy u swobodnie poruszających się zwierząt. Prowadzone są także analizy zawartości niektórych neuroprzekaźników post mortem w tkance. Do oceny oksydacyjnego uszkodzenia DNA w tkance mózgowej stosowany jest test kometkowy. Zespół II posiada też zestaw testów behawioralnych.

Obecne zainteresowania badawcze

1. Badanie mechanizmu działania i neurotoksyczności Nowych Substancji Psychoaktywnych

2. Badania nad aktywnością psychodelików w zwierzęcych modelach depresji i lęku

Metody badawcze

1. Metody biochemiczne i molekularne in vivo i ex vivo 

2. Badania behawioralne

Stosowane techniki

1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z detekcją elektrochemiczną i kulometryczną (High Performance Liquid Chromatography with Electrochemical and Coulochemical Detection)

2. Elektroforeza

3. Stereotaksja

Testy i modele

1. Mikrodializa mózgu u szczurów i myszy u swobodnie poruszających się zwierząt (Brain Microdialysis in freely moving rats and mice)

2. Oznaczanie zawartości neuroprzekaźników w strukturach mózgu szczura i myszy (homogenat, HPLC)

3. Test kometkowy (Comet Assay, oksydacyjne uszkodzenie jądrowego DNA)

4. Modele depresji: test wymuszonego pływania (Forced Swim Test, FST)

5. Modele lęku: wolne pole (Open Field, OF), test jasnego/ciemnego pudełka (Light/Dark test, LDB)

6. Modele zaburzeń funkcji poznawczych: test rozpoznania nowego obiektu (Novel Object Recognition, NOR)

7. Model aktywności halucynogennej u szczurów: test otrzepywania u szczurów (Wet Dog Shake test, WDS)

Najważniejsze dwa odkrycia w ciągu 3 ostatnich lat

1. Wykazanie funkcjonalnej interakcji receptorów serotoninowych 5-HT2A i 5-HT1A we wpływie psylocybiny na uwalnianie dopaminy, glutaminianu i GABA w korze czołowej szczura

2. Wykazanie zależności aktywności halucynogennej związków 25I-NBOMe i 25B-NBOMe od zwiększonego uwalniania glutaminianu w korze czołowej szczura w wyniku pobudzenia receptorów serotoninowych 5-HT2A oraz neurotoksyczności tych związków wynikającej z generowania stresu oksydacyjnego 

Słowa kluczowe: dopamina, noradrenalina, serotonina, glutaminian, GABA, acetylocholina, adenozyna, receptory, nowe substancje psychoaktywne, psychodeliki, halucynogeny, psychostymulanty, depresja, lęk, neurotoksyczność, uszkodzenie DNA, stres oksydacyjny, leki przeciwdepresyjne, leki przeciwpsychotyczne