„Wytnij i wklej” – czyli jak „białkowe nożyczki” pomagają naukowcom modelować choroby neurodegeneracyjne


Mgr Justyna Barut

Zakład Biochemii Mózgu, Instytut Farmakologii im. Jerzego Maja PAN

I miejsce w Konkursie na Artykuł Popularnonaukowy dla Młodych Naukowców IF PAN

 



Wobec prognoz zwiększającej się w naszym społeczeństwie populacji osób starszych, szczególne zainteresowanie poświęca się chorobom neurodegeneracyjnym. Poszukiwanie markerów wczesnej fazy tych chorób, jak i efektywnych terapii spowalaniających rozwój degeneracji jest celem wielu naukowców. Dużą rolę w tym temacie odgrywają badania na modelach transgenicznych, które dzięki postępowi techniki są coraz bardziej wydajne i ograniczające liczbę zwierząt. Przełomowymi w tej dziedzinie badań są narzędzia opierające się na edycji genomu, jak np. metoda CRISPR-cas9, nazywana potocznie „molekularnymi nożycami” (1). Inspiracją do rozwoju tej techniki była natura, CRISPR/Cas jest to mechanizm immunologiczny bakterii, który rozpoznaje sekwencje obcego kwasu nukleinowego i degraduje go podczas kolejnej infekcji.

Mechanizm działania CRISPR/Cas9
CRISPR składa się z fragmentu kwasu nukleinowego - gRNA (ang. guide RNA) oraz białka, endonukleazy DNA, nazywanej Cas9 (rys.1). gRNA, które można zaprojektować samemu nakierowuje system CRISPR do miejsca, w którym DNA zostanie przecięte, a enzym Cas rozkłada DNA we wskazanym miejscu. Następnie mechanizmy naprawcze DNA w miejsce cięcia wklejają fragment zapisany w sekwencji gRNA. Mechanizm ten daje nam możliwość usunięcia białek, których brak doprowadzi do śmierci komórki (jak to ma miejsce w chorobach neurodegeneracyjnych). Uruchomienie mutacji in vivo, czyli bezpośrednio w interesującej nas strukturze mózgu zwierzęcia daje możliwość zbadania behawioru i testowania ukierunkowanej terapii. Aby to uzyskać, nasz konstrukt genetyczny musimy zamknąć w odpowiednim wektorze, który dostarczy oraz uruchomi swój mechanizm w docelowych komórkach.

                                                                                                                    


Wektory wirusowe

Zaprojektowane wektory wykorzystują właściwości wirusów- infekują komórki i dostarczają obcy materiał genetyczny w procesie nazywanym transdukcją. Wektory celowo pozbawione są infekcyjności i aby stworzyć funkcjonalną cząsteczkę wirusa używa się nośników cząsteczek DNA, czyli plazmidów, z których każdy zawiera inną sekwencję (rys.2a). Obecnie używane jest pięć typów wirusów różniących się właściwościami, a w naszym laboratorium stosujemy lentiwirusy, czyli retrowirusy, z przedstawicielem HIV-1 (rys.2b). Wektor dostarczany jest do mózgu podczas operacji stereotaktycznej przy użyciu mikrostrzykawki. W miejscu podania wirusy infekują wszystkie komórki, natomiast ekspresja wprowadzonego genu ujawnia się tylko w populacji komórek, w których znajduje się identyczna sekwencja jaka jest zapisana w konstrukcie (sekwencja „promotora”).                

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                       


Zastosowanie w badaniach nad chorobą Parkinsona
Choroba Parkinsona (PD) jest powoli postępującą chorobą neurodegeneracyjną, w której za bezpośrednie objawy (sztywność mięśniowa, drżenie kończyn) odpowiada utrata neuronów dopaminowych występujących w specyficznych strukturach mózgu: istocie czarnej i polu brzusznym nakrywki. Neurony dopaminowe produkują neurotransmiter dopaminę, która jest odpowiedzialna między innymi za koordynację ruchową. Redukcja poziomu dopaminy wywołuje charakterystyczne, motoryczne objawy PD. Są one widoczne dopiero gdy degeneracja neuronów dopaminowych osiągnie ok. 80%, co daje już niewielkie pole manewru dla wprowadzenia ewentualnej terapii. Do tej pory, aby otrzymać model choroby Parkinsona zwierzętom podawana jest specyficzna toksyna, która w bardzo szybkim czasie powoduje utratę neuronów dopaminowych. W naszym laboratorium, dzięki precyzyjnej technice CRISPR/Cas9 i odpowiedniemu doborowi gRNA możemy zaindukować i dobrze odzwierciedlić proces powolnej degeneracji neuronów (Rys.3). Daje to możliwość dokładnego zbadania jak choroba się rozwija na wczesnych etapach i jak ją rozpoznać zanim będzie zbyt późno na reakcję.
                                                                                                                


W ostatnich latach zwrócono uwagę na postępującą degenerację również innych struktur mózgowych, powiązanych z układem dopaminowym w PD, w szczególności komórek produkujących noradrenalinę w obrębie miejsca sinawego (2). Wydaje się, że degeneracja układu noradrenergicznego może poprzedzać utratę komórek dopaminowych, a sam układ noradrenergiczny może stać się ważnym celem dla farmakoterapii. W naszych badaniach podjęliśmy próbę stworzenia modelu wczesnej fazy PD z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9, dzięki któremu być może będzie możliwe poszukiwanie markerów rozwijającej się choroby na jej wczesnym, przed-objawowym stadium. Skonstruowany przez nas wektor uaktywnia swój mechanizm tylko w populacji neuronów, które produkują noradrenalinę. W efekcie komórki nie są zdolne do wytworzenia czynnika transkrypcyjnego TIF-1A, bez którego ulegają powolnej degeneracji, co wydaje się mieć późne, negatywne skutki na funkcjonowanie układu dopaminowego (3).



1.    Doudna & Charpentier: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014
2.    Braak et al.: Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Research, 2004
3.   Kreiner G., & Rafa-Zablocka K., et al.: Stimulation of noradrenergic transmission by reboxetine is beneficial for a mouse model of progressive parkinsonism. Scientific Report, 2019


 



Pliki do pobrania